Esta guía compara los métodos más comunes para extraer ADN y ARN y explica cómo un colector de vacío para microplacas reemplaza la centrífuga en la extracción en fase sólida con columnas o placas de 96 pocillos.
Qué es la extracción de ácidos nucleicos
La extracción (también llamada aislamiento o purificación) de ácidos nucleicos separa, purifica y concentra ADN y ARN desde distintas muestras. Primero se rompen por vía física o química las estructuras de la célula, como el núcleo, la membrana celular, la membrana nuclear o la pared celular, para liberar los ácidos nucleicos. Después, esas moléculas se purifican y concentran.
El ADN y ARN extraídos se usan en PCR, PCR cuantitativa, secuenciación de genes y Southern blot. La extracción también se aplica en el diagnóstico clínico de virus y la detección microbiana, por ejemplo en la detección de nuevos coronavirus y el diagnóstico de sepsis.
Etapas de la extracción
- Lisis celular: se usan tampón de lisis, calor o ambos para romper la membrana celular y la envoltura nuclear. Según la muestra, el lisado suele llevar SDS y puede incluir enzimas (por ejemplo, proteinasa K), un quelante (EDTA) o tampón Tris.
- Separación y purificación: se eliminan impurezas del lisado, como lípidos y proteínas.
- Concentración y precipitación: como siguen quedando impurezas, se aplica precipitación, por ejemplo con alcohol, para purificar y concentrar más los ácidos nucleicos.
Compare los métodos de extracción
| Tipo | Método | Molécula objetivo | Ventajas | Limitaciones |
|---|---|---|---|---|
| Químico | Fenol-cloroformo | ADN, ARN | Mayor pureza; mayor rendimiento; menor costo | El fenol es tóxico; el cloroformo es cancerígeno |
| Químico | Extracción alcalina | ADN plasmídico | Más rápida; fácil de operar | Menor pureza; se contamina fácilmente con ADN cromosómico fragmentado; sólo sirve para aplicaciones posteriores de menor sensibilidad |
| Químico | Centrifugación en gradiente de CsCl/EtBr | ADN bacteriano, cromosómico, de plastidios, ribosómico y mitocondrial | Mayor pureza; mayor rendimiento | Equipo muy costoso; mucho trabajo y más tiempo; el EtBr es genotóxico, cancerígeno y teratogénico |
| Fase sólida | Extracción con sílice | ADN, ARN | Alta afinidad y especificidad por los ácidos nucleicos; rápida y fácil de operar; alta reproducibilidad | No recupera bien los ácidos nucleicos pequeños |
| Fase sólida | Perlas magnéticas | ADN cromosómico, de plastidios y mitocondrial; ARN | Rápida; fácil de operar; requiere menos herramientas; fácil de automatizar; menos daño a los ácidos nucleicos por el esfuerzo de corte de la centrifugación | Menos rentable |
Extracción en fase sólida con columnas o microplacas
La extracción en fase sólida (SPE) permite obtener ácidos nucleicos de alta pureza, concentración y rendimiento, tanto de muestras traza como de grandes cantidades de muestras. Para procesar muchas muestras existen kits comerciales; los más usados emplean columnas de centrifugación (spin columns) o microplacas de 96 pocillos. Como la mayoría usa sílice como fase sólida, el método también se conoce como extracción con sílice.
El procedimiento básico es:
- Lisis: agregue tampón de lisis a las células para romper la membrana y otras estructuras.
- Unión (adsorción): los ácidos nucleicos se unen a la fase sólida; las demás moléculas atraviesan la columna y se recogen en un tubo para descartarlas.
- Lavado: use un tampón de lavado para eliminar impurezas e interferencias.
- Elución: use un tampón de elución, por ejemplo una solución hipoosmótica como agua, tampón TE o tampón Tris, para liberar los ácidos nucleicos y recogerlos en un tubo.
Con centrífuga, cada paso requiere centrifugar a alta velocidad para que el líquido atraviese la fase sólida. Retirar tubos, descartar líquido, cambiar tubos y agregar reactivos una y otra vez es tedioso y lento.
Centrífuga o colector de vacío
Una fuente de vacío puede reemplazar la centrífuga y simplificar la purificación de ADN plasmídico, ADN monocatenario (ssDNA), ARN, ADN genómico y ácidos nucleicos virales.
| Aspecto | Centrífuga | Vacío |
|---|---|---|
| Equipo | Centrífuga | Colector de vacío para microplacas |
| Parámetro | Tiempo y velocidad de rotación | Vacío (use el que recomienda el fabricante de la microplaca o columna) |
| Número de muestras | Según la capacidad del rotor | Máximo 96 a la vez, con microplaca de 96 pocillos |
| Visibilidad | Sólo al terminar la centrifugación | En cualquier momento |
| Adición de reactivos | Sólo antes de centrifugar | En cualquier momento |
| Retiro de líquido | Tubo por tubo | El líquido se reúne en una placa o botella, que se limpia una sola vez al final |
| Mantenimiento | Más difícil, por su estructura compleja | Mucho más fácil |
| Tiempo de proceso | Más largo | Más corto |
| Peso | Más pesada | Más liviano y fácil de mover |
| Otros | Hay que equilibrar bien la carga | Se recomienda agregar una botella para recoger los residuos líquidos |
Rocker propone dos equipos para este trabajo:
- WelVac 200: colector de vacío para microplacas. Su placa adaptadora de columnas (24 orificios) y su conector luer le permiten trabajar con distintos tipos de columnas de centrifugación y microplacas de 96 pocillos.
- WelVac 210: sistema de filtración para microplacas que incluye bomba.
Según Rocker, el colector WelVac permite purificar muestras de forma rápida y continua, sin pasos repetidos de centrifugación. Entre los productos recomendados para esta aplicación, la fuente incluye también una bomba de vacío y una botella de vacío de PES de 1200 mL, que la ficha del WelVac 210 lista como accesorio opcional. Ajuste el vacío al valor que indique el fabricante de la microplaca o columna.
Aplicaciones
- Biología molecular: expresión y regulación génica, mutaciones génicas.
- Genética: genotipificación, mapeo génico, detección de mutaciones, pruebas de paternidad.
- Diagnóstico: detección de cáncer, virus y enfermedades genéticas, y de polimorfismos de un solo nucleótido.
- Investigación biológica: identificación de especies.
- Criminalística: comparación de ADN de huellas dactilares, mucosas y fluidos corporales.
Equipos relacionados en Cotecno
Consulte la configuración y variante en cada ficha antes de seleccionar el equipo.
- Manifold de vacío para microplacas WelVac 200
- Sistema de filtración para microplacas WelVac 210
- Bomba de vacío sin aceite Rocker 300
- Bomba de vacío sin aceite Rocker 300DC
- Botella de vacío de PES de 1200 mL
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