Esta guía resume qué es el ELISA, cómo se diferencian sus cuatro formatos y por qué el lavado entre etapas es clave para evitar falsos positivos y fondo alto. También le ayuda a comparar el lavado manual con un lavador de microplacas.
Qué es el ELISA
El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), también llamado inmunoensayo enzimático (EIA), aprovecha la unión específica entre antígeno y anticuerpo sobre una superficie sólida, como una placa de micropocillos. La detección se hace con anticuerpos o antígenos marcados con una enzima reportera; la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (AP) son ejemplos comunes.
Según el propósito del análisis, el ELISA puede ser:
- Cualitativo: indica si la molécula buscada está presente o ausente en la muestra.
- Cuantitativo: mide la concentración de la molécula objetivo a partir de una curva estándar, comparando la absorbancia de la muestra con concentraciones conocidas.
- Semicuantitativo: estima la concentración relativa comparando la muestra con un patrón de concentración conocida.
Elija el formato de ELISA
La fuente distingue cuatro formatos. La elección depende de lo que quiere detectar y de los anticuerpos disponibles.
| Formato | Cómo funciona | Ventajas | Desventajas | Objetivo adecuado |
|---|---|---|---|---|
| Directo | Se inmoviliza el antígeno y se detecta con un anticuerpo primario marcado con enzima | Más rápido; sin interacción de anticuerpo secundario | Menor sensibilidad; pueden aparecer falsos positivos o interferencias; requiere un anticuerpo primario específico marcado con enzima, lo que demanda tiempo y es costoso | Antígeno |
| Indirecto | Se inmoviliza un antígeno conocido, se agrega el anticuerpo primario y luego un anticuerpo secundario marcado con enzima | Mayor sensibilidad; admite distintos anticuerpos primarios; menor costo | Interacciones del anticuerpo secundario | Anticuerpo |
| Sándwich | Dos anticuerpos reconocen específicamente el antígeno de la muestra | No requiere muestra purificada; mayor sensibilidad; alta especificidad | Requiere anticuerpos primario y secundario específicos; el antígeno debe ser multivalente; análisis lento y costoso | Antígeno macromolecular |
| Competitivo | El antígeno de la muestra y una biomolécula marcada con enzima compiten por el antígeno o anticuerpo inmovilizado | No requiere muestra purificada; detecta la mayoría de los antígenos en una sola muestra; menor variabilidad | Menor especificidad; no es adecuado para muestras diluidas | Haptenos y antígenos de molécula pequeña |
Algunos puntos de cada formato:
- Directo: usa un solo anticuerpo, normalmente sobre una placa de 96 pocillos. Es el más simple, pero no amplifica la señal.
- Indirecto: suele usarse para detectar anticuerpos; la fuente menciona como ejemplo frecuente la detección de anticuerpos contra el VIH. Para reducir las señales inespecíficas del anticuerpo secundario se agrega una solución de bloqueo.
- Competitivo: la señal es inversamente proporcional a la concentración del antígeno. A más antígeno en la muestra, menos anticuerpo marcado se une y menor es la señal de color.
Por qué aparecen falsos positivos o fondo alto
El ELISA puede dar resultados inestables: falsos positivos, valores de fondo altos o señal baja o nula. Según la fuente, los falsos positivos y el fondo alto se deben en parte a que los anticuerpos o antígenos no unidos, o las impurezas, no se eliminan por completo entre etapas.
Lave entre cada etapa
Para reducir esos problemas, realice un lavado entre cada etapa del ensayo. El lavado elimina reactivos inespecíficos o de baja afinidad.
- Tampón de lavado: habitualmente PBS o TBS, con un surfactante para reducir la unión inespecífica, por ejemplo Tween-20 o Triton X-100 entre 0,01 % y 0,1 %.
- Número de lavados: en general, cada paso de lavado requiere entre 2 y 5 lavados con tampón.
- Lavado manual: elimine sacudiendo la solución de reacción residual y agregue de inmediato la siguiente solución, para que los pocillos no se sequen en exceso.
Lavado manual o lavador de microplacas
| Aspecto | Lavado manual | Lavador de microplacas |
|---|---|---|
| Aspiración | Micropipeta con secado manual por giro | Dispensador |
| Dispensación | Micropipeta y piseta | Dispensador |
| Posición de la microplaca | Plana | Plana u horizontal |
| Líquido residual | Se inclina la placa a mano | Se sugiere un equipo que permita inclinarla |
| Autoclavable | Depende del dispensador | Generalmente autoclavable |
| Costo | Menor | Considere el costo del sistema completo, incluida la bomba de vacío |
Rocker ofrece los lavadores de microplacas BioWasher 100 y BioWasher 100 – T. Según sus fichas Rocker, BioWasher 100 es un lavador manual alimentado por gravedad, sin electricidad, para microplacas de 96 pocillos y tiras de 8 tubos. Su dispensador de 8 canales tiene dos filas de tubos de distinta altura para evitar la contaminación cruzada entre pocillos: los tubos cortos distribuyen la solución de lavado y los largos aspiran el líquido residual por vacío. Las piezas del dispensador en contacto con el líquido son de PTFE y acero inoxidable SS304 y son autoclavables. El soporte permite dejar la placa plana o inclinada para reducir el líquido residual.
BioWasher 100 es el kit de lavado y no incluye bomba de vacío. BioWasher 100 – T es el sistema completo: incluye el kit BioWasher 100, una botella de tampón de PP de 4000 mL, la bomba de vacío Lafil 200, una botella de vacío de PP de 4000 mL con conector rápido y tubo de silicona. Revise en la ficha y el manual de cada modelo la configuración que necesita.
ELISA y PCR
El ELISA y la PCR suelen compararse, pero miden cosas distintas:
- ELISA: detecta proteínas, como antígenos o anticuerpos, mediante la unión antígeno-anticuerpo y una reacción de color catalizada por una enzima.
- PCR: amplifica fragmentos de ADN para detectar patógenos o genes de interés.
En la detección de coronavirus, la fuente compara un ELISA sobre suero, que busca anticuerpos para confirmar si la persona fue infectada, con una PCR sobre saliva, que analiza ADN obtenido por transcripción inversa del ARN para detectar si el virus está presente. Por eso, en epidemiología, combinar ambas técnicas puede dar una detección más completa de virus u organismos, por ejemplo del virus de la viruela símica (MPV), hantavirus o norovirus.
Aplicaciones del ELISA
- Medicina clínica: diagnóstico de cáncer, enfermedades autoinmunes e infecciosas.
- Detección de virus: SARS-CoV-2, VIH, virus del Nilo Occidental, entre otros.
- Pruebas en el punto de atención: pruebas de embarazo caseras.
- Investigación académica: cuantificación de ADN/ARN, señalización celular, vías metabólicas, expresión y regulación génica.
- Inocuidad alimentaria: alérgenos alimentarios.
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