Esta guía le ayuda a elegir un método para aislar y concentrar exosomas y otras vesículas extracelulares (EV). Compara los métodos habituales, explica qué diferencia a la filtración de flujo tangencial (TFF) de la ultrafiltración convencional y resume combinaciones de métodos publicadas.
Qué son las vesículas extracelulares
Los exosomas son vesículas diminutas liberadas por las células. Contienen biomoléculas, como proteínas y secuencias, que pueden modificar el funcionamiento de las células cercanas. Por eso se estudian para entender la comunicación entre células y el desarrollo de enfermedades.
La fuente distingue tres tipos de vesículas extracelulares:
| Tipo | Tamaño | Origen |
|---|---|---|
| Exosomas | 40~120 nm | Cuerpos multivesiculares (MVB), vía endolisosomal |
| Microvesículas | 100~1000 nm | Membrana plasmática, gemación hacia el exterior |
| Cuerpos apoptóticos | 1000~5000 nm | Membrana plasmática, durante la apoptosis |
Como el origen biológico de cada vesícula es difícil de demostrar, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV) recomendó en su guía MISEV2018 nombrarlas por:
- Características físicas: por ejemplo, tamaño pequeño, mediano o grande (sEV, mEV, lEV) o densidad.
- Marcadores de superficie o composición bioquímica: por ejemplo, EV CD81+ o EV teñidas con anexina A5.
- Condiciones o célula de origen: por ejemplo, EV de podocitos, EV hipóxicas, oncosomas grandes o cuerpos apoptóticos.
Frente a portadores sintéticos como los liposomas y las nanopartículas, los exosomas son endógenos y heterogéneos. Pueden transportar sustancias bioactivas a células diana y participar en procesos como la reparación de tejidos, la regulación inmunitaria, la angiogénesis, la diferenciación celular y la neoplasia. Sus limitaciones para uso clínico son la baja estabilidad, el bajo rendimiento, la baja pureza y la débil capacidad de dirigirse a un blanco.
Por qué aislar exosomas es difícil
Aislar, purificar y concentrar (enriquecer) los exosomas es necesario para evaluar su función y usarlos en análisis posteriores. Sin embargo, las muestras biológicas contienen estructuras parecidas, como fragmentos celulares, agregados de proteínas y lipoproteínas. Además, el tamaño y la composición de los exosomas son heterogéneos.
Compare los métodos de aislamiento
Los métodos más usados son la ultracentrifugación, la cromatografía de exclusión por tamaño, la ultrafiltración, la precipitación y la inmunoafinidad.
| Criterio | Ultracentrifugación (UC) | Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) | Ultrafiltración (UF) | Precipitación | Inmunoafinidad (IA) |
|---|---|---|---|---|---|
| Principio | Coeficiente de sedimentación (tamaño, densidad) | Radio hidrodinámico (tamaño, peso molecular) | Tamaño de poro de la membrana (tamaño, peso molecular) | Solubilidad (carga superficial) | Unión específica (marcador proteico de membrana) |
| Rendimiento | Bajo | Medio | Alto | Alto | Bajo |
| Pureza | Media (lipoproteínas) | Media a alta (lipoproteínas, albúmina) | Media (proteínas) | Baja (proteínas, polímeros) | Alta |
| Funcionalidad | Media | Alta | Media | Baja | Baja |
| Tiempo | > 4 h | 0,3 h (1) | < 4 h | ≈0,3~12 h | 4~20 h |
| Volumen de muestra | Grande | Medio | Grande (TFF) | Grande | Pequeño |
| Desnaturaliza o inactiva las EV | Sí (alta velocidad) | No | Sí (esfuerzo de corte) | Sí (coprecipita con proteínas o polímeros) | Sí (pasos de refinamiento) |
| Complejidad | Media | Simple | Simple | Simple | Media |
| Escalabilidad | Media | Alta | Media a alta (2) | Alta | Baja |
| Otros | Laboriosa y lenta | Alta reproducibilidad; las EV conservan función y forma | Alta reproducibilidad; uso flexible; la membrana se obstruye | Polímeros difíciles de separar; kit más costoso | Mejor pureza; permite estudiar subpoblaciones específicas; no separa las EV totales; anticuerpos costosos |
(1) Con kits comerciales, la purificación de EV puede completarse en 20 minutos. (2) La escalabilidad alta corresponde a la filtración de flujo tangencial (TFF).
La ultracentrifugación (UC) también se denomina centrifugación diferencial (dUC).
Ultrafiltración convencional frente a TFF
La ultrafiltración separa por tamaño molecular. Puede hacerse con tubos de ultrafiltración por centrifugación, con filtros agitados a presión o con filtración de flujo tangencial (TFF).
- Tubos de centrífuga y filtros agitados: son fáciles de operar y rápidos, pero la membrana se obstruye con facilidad. Eso reduce la eficiencia de separación y aumenta el costo.
- TFF: reduce de forma importante el problema de obstrucción de la membrana.
Según la fuente, varios trabajos indican que, al separar EV, la TFF supera a la ultracentrifugación (UC o dUC), considerada el estándar de referencia, en rendimiento, reproducibilidad y eliminación de contaminantes. También ahorraría más de 40 % del tiempo y se adapta mejor a la producción a gran escala.
Combine métodos para mejorar pureza y rendimiento
Ningún método cumple por sí solo con alta pureza y alto rendimiento. Por eso muchos equipos combinan técnicas; la fuente señala que la combinación aumenta el rendimiento y la pureza más que un método único. Algunos ejemplos:
- UC y UF para una extracción inicial, seguidas de IA para purificar los exosomas objetivo.
- UC y SEC para procesar volúmenes grandes y reducir la interferencia de contaminantes.
Al combinar métodos, revise si alguno puede desnaturalizar o inactivar los exosomas.
La fuente recopila ocho estudios (2018 a 2023) que usan TFF junto con otras técnicas:
| N.° | Objetivo | Combinación | Función de la TFF | Poro o corte de la membrana | Muestra |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Exosomas | TFF → SEC | Purificación y concentración | 5 nm | Medio de cultivo celular (DP-MSC) |
| 2 | EV | TFF → SEC | Purificación y concentración | 50 ± 10 nm | Sobrenadante de HPL |
| 3 | Exosomas | UC → TFF | Concentración | 5 nm | Medio de cultivo celular (células NK-92) |
| 4 | EV vegetales | dUC → TFF | Concentración | 5 nm | Medio de cultivo celular (tabaco) |
| 5 | Exosomas | (TFF) → kit exoEasy Maxi (Qiagen) / SEC | Concentración (10~20X) | 5 nm | Medio de cultivo celular (células cancerosas) |
| 6 | Exosomas | Centrifugación a baja velocidad (300g) → TFF | Purificación y concentración | 100 kDa | Medio de cultivo celular (EF-MSC) |
| 7 | EV | Centrifugación a baja velocidad (300g) → TFF | Purificación y concentración (50X) | 300 kDa | Medio de cultivo celular (ASC) |
| 8 | EV | TFF | Purificación, concentración (4~20X) y cambio de tampón | 0,65 μm, 500 kDa | Medio de cultivo celular; lipoaspirado |
Equipo Rocker para TFF a escala de laboratorio
Rocker recomienda para esta aplicación el sistema de filtración de flujo tangencial Tanfil 100. Según el fabricante:
- Es un sistema todo en uno, listo para conectar y comenzar.
- Concentra y hace diafiltración en la misma corrida.
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- Cuenta con certificaciones CE, RoHS y UKCA.
La página de Rocker también incluye entre sus productos recomendados los lavadores de microplacas BioWasher 100 y BioWasher 100-T, sin detallar su uso en este flujo. Su función se explica en la guía de ELISA.
Aplicaciones de los exosomas
- Diagnóstico y pronóstico: biomarcadores para medicina de precisión y predicción del curso de enfermedades como Alzheimer, Parkinson, enfermedades autoinmunes y neurodegenerativas, y cáncer.
- Tratamiento: fármacos moleculares, agentes terapéuticos y vehículos de fármacos para el tratamiento del cáncer, la medicina regenerativa y otros campos.
- Investigación biológica: estudio de ADN, miARN y otras moléculas para entender mecanismos fisiológicos y patológicos.
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