Las vesículas extracelulares (EVs) despiertan creciente interés en biología y medicina por su potencial como biomarcadores y herramientas terapéuticas. Su heterogeneidad y complejidad, sin embargo, plantean desafíos a quien empieza. Esta guía, basada en las directrices MISEV2023, resume los pasos fundamentales de un estudio de EVs: recolección y preprocesamiento, separación y concentración, caracterización y almacenamiento. Para el detalle técnico del aislamiento por filtración de flujo tangencial (TFF), consulte la guía de aislamiento de exosomas.
Qué son las vesículas extracelulares y los exosomas
Las EVs son partículas liberadas por las células, delimitadas por una bicapa lipídica e incapaces de autorreplicarse. Los primeros estudios las clasificaron en tres tipos según su biogénesis y tamaño:
| Exosomas | Microvesículas | Cuerpos apoptóticos | |
|---|---|---|---|
| Tamaño | 40–120 nm | 100–1000 nm | 1000–5000 nm |
| Biogénesis | Cuerpos multivesiculares (MVB), vía endosomal | Membrana plasmática, por gemación hacia el exterior | Membrana plasmática, durante la apoptosis |
| Marcadores y composición | Tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), Alix, Tsg101, flotilina-1 | Selectinas, integrinas | ADN, histonas, organelos, fracciones nucleares, anexina V |
Según la International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), en MISEV2018 y MISEV2023, cuando la biogénesis es desconocida conviene usar términos operativos basados en características físicas, marcadores de superficie, origen celular o morfología, como sEV (EVs pequeñas), lEV (EVs grandes) o EVs CD63+.
El término "exosoma" se refiere específicamente a EVs derivadas del sistema endosomal y liberadas a través de MVB. Como suele ser difícil demostrar directamente esa biogénesis, no debe usarse sin evidencia. Su tamaño típico es de 40–120 nm y se caracterizan por tetraspaninas (CD9, CD63, CD81). Transportan información molecular de la célula de origen (ADN, ARN, lípidos y proteínas), influyen en la función de las células receptoras y participan en muchos procesos fisiológicos y patológicos.
El flujo de trabajo en cuatro pasos
Cada paso, desde la recolección de la muestra hasta el análisis y el almacenamiento, afecta la calidad de las EVs.
1. Recolección y preprocesamiento
Objetivo: obtener material biológico que contenga EVs y eliminar células o contaminantes lo antes posible. Las EVs pueden recolectarse de medio condicionado por células, bacterias, sangre, orina, leche y otras matrices.
- Registre el origen de la muestra, el volumen o peso, la recolección y el almacenamiento.
- Elimine las células temprano, para evitar artefactos o cambios de composición causados por células dañadas.
- Preprocese las muestras antes de almacenarlas para eliminar sustancias interferentes.
- Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Documente las condiciones de almacenamiento: conservantes, crioprotectores, temperaturas, duraciones y procedimiento de descongelación.
Para recomendaciones específicas por tipo de muestra, consulte MISEV2023.
2. Separación y concentración
Objetivo: aislar y concentrar las EVs minimizando contaminantes que no son EVs, como proteínas libres o restos celulares. Las técnicas habituales son ultracentrifugación diferencial (dUC), gradiente de densidad (DG), ultrafiltración (UF), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y métodos de precipitación.
- Elija el método según el tipo de muestra, el objetivo de la investigación y la pureza o el rendimiento requeridos.
- Combine técnicas complementarias para lograr mayor pureza.
- Preconcentre los volúmenes grandes (por ejemplo, orina o leche) antes del aislamiento.
- Prefiera kits con protocolos transparentes.
- Informe datos de pureza y recuperación, y entregue todos los detalles del método para que sea reproducible.
- Evalúe el factor de enriquecimiento y el rendimiento después de cada paso.
Ningún método por sí solo entrega EVs completamente puras. La combinación de técnicas complementarias puede mejorar tanto el rendimiento como la pureza.
3. Caracterización
Objetivo: confirmar que las partículas aisladas son efectivamente EVs, analizando tamaño, morfología y biomarcadores. Se cuantifica la concentración de partículas, el contenido de proteínas, lípidos y ARN, y las características morfológicas.
- Caracterice en tres niveles: (1) propiedades físicas, como tamaño y concentración; (2) marcadores de EVs, como proteínas transmembrana o ancladas a GPI; y (3) contaminantes que no son EVs, es decir, proteínas coaisladas que sirven como marcadores negativos de pureza.
- Use métodos ortogonales, con distintos límites de detección.
- Informe instrumentos, parámetros y métodos de análisis de datos, además del límite de detección (LOD).
- Exprese el rendimiento respecto de la fuente biológica: número de células, volumen o peso de tejido.
- Cuantifique el número de partículas y el contenido de proteínas y lípidos.
- Verifique componentes específicos del subtipo de EV cuando corresponda.
- Use estándares, controles negativos y validación entre plataformas.
4. Almacenamiento
Objetivo: mantener la integridad y estabilidad de las EVs para su uso posterior. Un almacenamiento inadecuado puede alterar sus propiedades, estabilidad y funcionalidad.
- Registre todos los detalles: conservantes, temperatura, duración y ciclos de descongelación.
- Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación; separe en alícuotas cuando sea posible.
- Se recomienda congelar y descongelar rápidamente para preservar la morfología y la función de las EVs.
Errores frecuentes al comenzar
- Nomenclatura: no use "exosoma" sin demostrar la biogénesis; use "EVs" para evitar conclusiones engañosas.
- Contaminación de la muestra: el suero y los suplementos contienen EVs exógenas; use medio depletado de EVs o libre de suero.
- Interferencia celular: elimine las células de inmediato después de la recolección, para evitar partículas falsas similares a EVs.
- Separación inadecuada: elija el método según el tipo de muestra y la aplicación.
- Caracterización insuficiente: confirme con varios métodos y analice contaminantes como las lipoproteínas.
- Almacenamiento inadecuado: la temperatura y la congelación y descongelación dañan las EVs. Siga protocolos estandarizados y registre las condiciones.
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Rocker recomienda para esta aplicación un sistema TFF y un cartucho TFF, y remite a la purificación por TFF como lectura complementaria de la etapa de separación y concentración. Consulte la configuración en cada ficha antes de seleccionar el equipo.
Guías relacionadas
Fuentes
- Rocker, EVs Research Workflow
- Referencias citadas por Rocker: Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023) y MISEV2018 Guidelines (ISEV).